研究背景

恶性黑色素瘤是皮肤癌中蕞致命的类型。虽然它在所有皮肤癌中占比不到 5%，却导致了约 72% 的皮肤癌相关死亡。早期黑色素瘤患者通过手术切除，5 年相对生存率可达 99%；但晚期或转移性患者，生存率会大幅下降，区域转移性患者 5 年生存率为 68%，远处转移性患者仅 30%。目前，早期诊断黑色素瘤面临诸多挑战，传统诊断方法如视觉检查和触诊依赖医生经验，现有成像辅助手段，如反射共聚焦显微镜、光学相干断层扫描等，存在设备昂贵、有辐射等问题。近红外荧光成像虽有应用，但常用的吲哚菁绿（ICG）存在非特异性积累、激光穿透浅、光漂白快等缺点，导致假阳性率高、体内半衰期短。因此，开发更精准有效的黑色素瘤早期诊断方法迫在眉睫。方案 1 MC1R 靶向的 MSH-TPE-BBT 纳米颗粒的制备以及在 808 nm激光照射下荷黑色素瘤小鼠的近红外二区（NIR-II）荧光成像流程。实验过程本次实验旨在制备一种新型的黑色素瘤靶向荧光探针，并对其性能进行全面评估，为黑色素瘤的早期诊断提供新的技术手段。（一）材料准备研究团队基于聚集诱导发光源（AIEgen）四苯乙烯 - 苯并双噻二唑（TPE - BBT）和靶向 MC1R 的 α - MSH 类似物（DSPEPEG2000 - MAL - CGG - NLE - Cycic (DHRWK)-CONH2 ），制备了名为 MSH - TPE - BBT NPs 的纳米颗粒。实验材料均为市售，TPE - BBT 按文献合成，其他材料如 DSPE - PEG2000 - MAL、MC1R 靶向肽等从相应公司购买。此外，还获取了多种细胞培养相关试剂以及不同细胞系，如人恶性黑色素瘤细胞（A375）、鼠乳腺癌细胞（4T1）、鼠黑色素瘤细胞（B16F10），实验动物选用 BALB/c 裸鼠 。（二）纳米颗粒的制备本次实验制备了两种纳米颗粒，分别是带有 MC1R 靶向肽的 MSH-TPE-BBT NPs，以及未添加靶向肽的 TPE-BBT NPs，具体步骤如下：1.准备原料溶液：将1mg（0.84μmol）的 TPE-BBT溶解于1mL 的四氢呋喃（THF）中；另取 9mg（3.11μmol）的 DSPE-PEG2000-MAL溶解于1mL THF中；再将1mg（0.24μmol）的 DSPEPEG2000 - MAL - CGG - NLE - Cycic (DHRWK)-CONH₂溶解在适量的乙醇里。2.混合原料：将溶解好的DSPEPEG2000 - MAL - CGG - NLE - Cycic (DHRWK)-CONH₂乙醇溶液，倒入含有 DSPE-PEG2000-MAL 的 THF 溶液中，充分搅拌混合均匀。3.超声处理：向上述两种溶液中加入去离子水，并使用功率为 150W 的超声波设备对溶液进行处理，处理时间设定为10 min。通过超声促使分子更好地分散和相互作用，从而形成稳定且分散均匀的纳米颗粒溶液。4.搅拌与过滤：将经过超声处理的溶液在室温环境下持续搅拌24 h，使反应充分进行。搅拌结束后，利用 0.22μm 的针头过滤器对溶液进行过滤操作，去除其中可能存在的未反应完全的大颗粒杂质等。5.储存备用：经过过滤得到的溶液，就是初步制备好的纳米颗粒溶液。在后续实验使用前，通过超滤的方法对溶液进行处理，调整其浓度到合适的水平。随后，将溶液放置在 4°C 的黑暗环境中储存，避免光照和温度变化对纳米颗粒的性质产生影响 。

实验结果

（一）良好的材料特性

图 1 （a）TPE-BBT 在不同水分数（fw）的四氢呋喃（THF）/ 水混合液中的荧光发射光谱。（b）TPE-BBT 在 918nm 处的相对荧光强度（I/I₀）与 fw 的关系。I₀是 TPE-BBT 在 THF（fw = 0%）中的荧光发射强度。分子浓度：10⁻⁵mol/L；激发波长（λex） = 685nm。（c，d）（c）MSH-TPE-BBT 和（d）TPE-BBT 纳米颗粒的粒径和透射电镜（TEM）图像（插图）。标尺：100μm。（e - f）（e）MSH-TPE-BBT 纳米颗粒（λex = 685nm）、（f）TPE-BBT 纳米颗粒（λex = 685nm）和（g）吲哚菁绿（ICG，λex = 685nm）的吸收光谱和发射光谱。（h）水中五种不同浓度的 TPE-BBT 纳米颗粒以及在二氯乙烷（C₂H₄Cl₂）中的 IR26 在 850 至 1600nm 之间相应发射峰积分的吸光度拟合曲线。激发波长：808nm。（i）连续激光照射下，MSH-TPE-BBT 纳米颗粒（920nm 发射峰）、TPE-BBT 纳米颗粒（920nm 发射峰）和 ICG（810nm 发射峰）在各自相应发射峰处的相对荧光发射强度（I/I₀）。I₀：激光照射前的荧光峰强度；I：激光照射后的荧光峰强度。激发波长：808nm。（j）不同厚度鸡胸肉组织下 MSH-TPE-BBT 纳米颗粒、TPE-BBT 纳米颗粒和 ICG 的荧光图像。1：MSH-TPE-BBT 纳米颗粒；2：TPE-BBT 纳米颗粒；3：ICG。浓度：0.05mg/mL；激发波长：808nm；功率密度 = 0.7mW/cm²；1000nm 长通（LP）滤光片；曝光时间 = 100ms。（j 由睿光科技的NirVivo-Pro小动物活体成像系统拍摄）（k）MSH-TPE-BBT 纳米颗粒、TPE-BBT 纳米颗粒和 ICG 的荧光强度与穿透深度的拟合曲线。

通过¹HNMR、MALDI - TOF - MS 和元素分析确认 TPE - BBT 成功合成。它在二氯甲烷中 500 - 850nm 有强吸收，750 - 1200nm 有强荧光发射，且具有聚集诱导发光特性。MSH - TPE - BBT NPs 和 TPE - BBT NPs 粒径分别为 122.12nm 和 133.55nm，呈均匀球形，带负电荷，MSH - TPE - BBT NPs 体系更稳定。二者在 685nm 有蕞大吸收，910nm 有荧光峰，在 NIR - II 区发射优于ICG。TPE - BBT NPs 量子产率达 31.6%，MSH - TPE - BBT NPs 和 TPE - BBT NPs 光稳定性强，远优于ICG，且组织穿透能力也比 ICG 更强。（二）低毒且靶向性好

图 2 （a）用不同浓度的 MSH-TPE-BBT 纳米颗粒、TPE-BBT 纳米颗粒和 ICG 处理人黑色素瘤 A375 细胞 24h 后的细胞活力。（b）通过免疫细胞化学可观察到 MC1R 表达（红色）、细胞膜（用 DiO 标记，绿色）和细胞核（用 DAPI 标记，蓝色）。箭头分别指示 B16F10 细胞和 A375 细胞中 MC1R 的表达。比例尺：20μm。（c）通过蛋白质免疫印迹法检测 B16F10、A375 和 4T1 细胞中 MC1R 的表达。（d，e）（d）MSH-TPE-BBT 纳米颗粒或（e）TPE-BBT 纳米颗粒在 A375 细胞上孵育不同时间后产生的近红外二区（NIR-II）信号。（f）分别在 18h 和 24h 孵育后，A375 细胞与 MSH-TPE-BBT 纳米颗粒或 TPE-BBT 纳米颗粒孵育产生的 NIR-II 信号对比。L：MSH-TPE-BBT 纳米颗粒。R：TPE-BBT 纳米颗粒。（g）A375 细胞在与 MSH-TPE-BBT 纳米颗粒或 TPE-BBT 纳米颗粒孵育 18h 或 24h 后，NIR-II 信号的统计分析（ns 表示无显著性差异，** 表示 P < 0.01）。

CCK - 8 实验显示，在 0.01 - 0.12mg/mL 浓度范围内，MSH - TPE - BBT NPs 和 TPE - BBT NPs 对A375细胞毒性低，细胞存活率超 85%。免疫 ocytochemistry 和 Western blot 证实 A375 和 B16F10 细胞表达 MC1R，4T1 细胞不表达。细胞实验表明，MSH - TPE - BBT NPs 靶向性出色，24h 时其在 A375 细胞的荧光强度显著高于 TPE - BBT NPs。（三）体内成像效果佳

图 3（a）注射 MSH-TPE-BBT 纳米颗粒、TPE-BBT 纳米颗粒、ICG 或 PBS 后不同时间点小鼠的荧光图像。肿瘤以绿色圆圈表示。浓度：0.5mg/mL；激发波长（λex）=808nm；功率密度：0.7mW/cm²；1000nm 长通（LP）滤光片；曝光时间 = 30ms。（a 由睿光科技的NirVivo-Pro小动物活体成像系统拍摄）（b）各组肿瘤信号随时间变化的统计图。（c）注射后 36h 离体肿瘤的荧光信号和荧光成像（n=3）。曝光时间 = 100ms。（d-f）小鼠分别注射（d）MSH-TPE-BBT 纳米颗粒、（e）TPE-BBT 纳米颗粒和（f）ICG 36h 后，用红线标记的肿瘤的横截面荧光强度分布。线长：1cm。1：MSH-TPE-BBT 纳米颗粒；2：TPE-BBT 纳米颗粒；3：ICG；4：PBS。拍摄设别使用

给皮下黑色素瘤小鼠尾静脉注射 MSH - TPE - BBT NPs、TPE - BBT NPs 或 ICG 后，MSH - TPE - BBT NPs 在肿瘤的荧光信号 36h 达蕞强，且肿瘤滞留时间长、信号强，其肿瘤信号背景比（SBR）为 1.70，优于 TPE - BBT NPs 和 ICG。药代动力学研究发现，MSH - TPE - BBT NPs 和 TPE - BBT NPs 首先在肝脏和脾脏积累，MSH - TPE - BBT NPs 能逐渐到达并积累在肿瘤，而 ICG 在体内停留时间短、代谢快。血液生化指标和病理切片显示，MSH - TPE - BBT NPs 生物an全性良好。

图 4 （a）尾静脉注射 MSH-TPE-BBT 纳米颗粒、TPE-BBT 纳米颗粒和 ICG 后不同时间点，它们在体内的生物分布的荧光图像和明场图像。激发波长（λex）为 808nm；功率密度为 0.7mW/cm²；使用 1000nm 长通（LP）滤光片；曝光时间为 6ms。（a 由睿光科技的NirVivo-Pro小动物活体成像系统拍摄）（b - f）分别在注射 MSH-TPE-BBT 纳米颗粒、TPE-BBT 纳米颗粒或 ICG 后（b）24 小时、（c）36 小时、（d）48 小时、（e）168 小时和（f）360 小时，小鼠主要器官和肿瘤的荧光强度统计。1：MSH-TPE-BBT 纳米颗粒；2：TPE-BBT 纳米颗粒；3：ICG。He：心脏；Ki：肾脏；Li：肝脏；Sp：脾脏；Tu：肿瘤。

研究意义

图 5（a - d）注射 MSH - TPE - BBT 纳米颗粒前以及注射后 1 天、7 天和 14 天的血清生化分析，（a）谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）；（b）总蛋白（TP）；（c）肌酐（CREA）；（d）尿素氮（BUN）（n = 3）。（e）健康小鼠在注射 MSH - TPE - BBT 纳米颗粒前以及注射后 1 天、7 天和 14 天主要器官的病理切片（n = 3）。比例尺 = 100μm。

这项研究成功开发的 MSH - TPE - BBT NPs 纳米颗粒，在黑色素瘤早期诊断方面展现出巨大潜力。其良好的组织穿透性、光稳定性、生物an全性和特异性靶向性，克服了传统诊断方法和现有荧光探针的诸多缺陷。未来，有望进一步推动黑色素瘤早期诊断技术的临床转化，提高黑色素瘤患者的早期诊断率和生存率，为皮肤癌的防治开辟新路径。